S’initiant à l’expérimentation, il publia un premier travail sur l'anatomie et la physiologie de la corde du tympan (1843). Il multiplia ses recherches qui portèrent d’abord sur les phénomènes chimiques et la digestion qui le conduisirent à la découverte de la fonction glycogénique du foie, et à une théorie pathogénique sur le diabète sucré qui connut un grand retentissement.
En 1853, pour la quatrième fois, il obtint le prix de physiologie de l’Académie des sciences pour ses travaux sur le système nerveux sympathique et sa découverte capitale des nerfs vasomoteurs et des nerfs d’arrêt ou d’inhibition.
Membre de l’Académie des sciences (1854), la même année on créa pour lui une chaire de physiologie expérimentale à la Sorbonne et, l’année suivante, il remplaça Magendie au Collège de France comme professeur de médecine expérimentale.
Nommé professeur de physiologie comparée au Muséum (1868), il laissa sa chaire de la Sorbonne à Paul Bert. Elu à l’Académie française (1868), il devint sénateur sous le Second Empire (1869). Il était également président perpétuel de la Société de biologie.
En même temps, il contribua à étendre le champ de l’observation physiologique par ses recherches sur les poisons et les anesthésiques. En quelques années, il était devenu l’un des plus grands physiologistes français et européen.
Mais au-delà de ses travaux, par ses idées et ses méthodes, il eut une influence considérable que ses élèves contribuèrent à répandre. Jamais il ne perdit de vue les dimensions éthiques de la vie et de l'Homme. Ainsi a-t-il contribué à rapprocher Médecine, Sciences et Philosophie. Sa stature à la dignité imposante, liée à un caractère bienveillant épris de justice, participa probablement à son ascendance sur ses groupes d'étudiants. Il laissa de nombreux mémoires.
A sa mort, sa renommée était universelle. Sur proposition de Gambetta, la Chambre des députés lui vota des funérailles nationales. Avec empressement, les savants français et étrangers payèrent la statue en bronze le représentant, élevée sur le terre-plein du Collège de France, œuvre d’Eugène Guillaume (1822-1906), inaugurée en 1906. Fondue sous l’Occupation, elle a été remplacée par un monument en pierre réalisée par Raymond Couvègnes (1893-1985). Au cimetière du Père-Lachaise où il fut inhumé, on cherchera en vain un monument ostentatoire : le père de la physiologie moderne repose dans une tombe familiale qui n’attire pas particulièrement l’attention.