Mariée par ses oncles à un secrétaire des Commandements de la reine, Antoine Le Gras, un enfant naquit de cette union, Michel. La famille vivait paisiblement jusqu’à ce qu’Antoine, malade, devienne très irritable. Persuadée que cette maladie était la conséquence de son renoncement à la vie religieuse, elle sombra dans la dépression. Soutenue par son directeur spirituel, le théologien Jean-Pierre Camus, qui l’encouragea à rester fidèle à son devoir d’épouse, elle décida de se consacrer aux pauvres par une autre voie que la vie religieuse classique.
Veuve en 1625, elle quitta sa maison pour s’installer non loin de son directeur de conscience, Vincent de Paul. En 1629, ce dernier en fit sa collaboratrice et la chargea de visiter et d’animer les confréries de Charité qui connaissaient un grand succès en France, notamment auprès des Dames. En 1630, il lui fit rencontrer Marguerite Naseau, simple vachère de Suresnes qui, avec d’autres paysannes, voulait aider les Dames de la Charité pour les tâches les plus humbles auprès des malades.
Après une expérience de «mariage mystique» avec le Christ (1630), Louise envisagea de regrouper les filles en communauté, projet auquel adhéra Vincent de Paul. En 1633, la première compagnie des Filles de la Charité, institut féminin séculier au service des pauvres, vit ainsi le jour. Louise consacra le reste de sa vie à cette entreprise originale qui permet toujours à des filles, non contraintes à la clôture, de circuler dans le monde pour y accomplir leur mission caritative.
En 1642, elle fit vœu de se consacrer au service du Christ en la personne des pauvres, et poursuivit ses œuvres de charité. Elle contribua à la fondation des Enfants-Trouvés, où les Filles de la Charité étaient employées, hébergea les réfugiés lorrains fuyant la guerre de Trente Ans, secourut les malheureux pendant la Fronde, participa à la création de l’hospice du Saint-Nom-de-Jésus (1653), etc. En 1656, grâce au financement, en grande partie des Dames de la Charité, l’hôpital général de Paris, actuelle Salpêtrière, voyait le jour.
Louise de Marillac précéda de six mois Vincent de Paul dans la tombe. Deux jours après sa mort, elle fut inhumée dans l'ancienne chapelle Saint-Domnole (actuelle chapelle Saint-François-de-Sales) de l’église Saint-Laurent, sa paroisse, contigüe au logis des Filles de la Charité. Vingt ans plus tard, son fils, Michel, demanda que le cercueil en bois soit remplacé par un en plomb. En 1755, ses cendres furent transférées dans une autre chapelle plus proche des Filles de la Charité.