Remarqué par Lapeyronie, célèbre chirurgien de Louis XIV, qui le fit venir à Paris, il y débuta une longue et brillante carrière. Professeur de physiologie, chirurgien de l'hôpital de la Salpêtrière, élu membre de l'Académie Royale de chirurgie (1746), il soutient, en 1749, une thèse en latin qui traitait des « propositiones anatomicae et chirurgicae de vulneribus capitis », première thèse du genre présentée aux Ecoles de chirurgie, qui eut une grande influence sur le futur de cet art en lui donnant ses lettres de noblesse.
Choisi pour rédiger la partie chirurgicale de l'Encyclopédie de Diderot et d'Alembert, chirurgien-major de l'hôpital de la Charité, il fut nommé chirurgien consultant de l'Armée du Rhin de 1761 à 1763, après une mésentente avec les Frères de la Charité qui le firent destituer. Inspecteur général des hôpitaux du royaume, il fut élu Secrétaire perpétuel de l'Académie Royale de chirurgie (1764), poste où il déploya une activité intense et qui fut la période la plus féconde de sa vie. On ne compte plus ses contemporains qui louèrent son savoir, voire son génie pour certains.
Réfutant l’efficacité de traitements alors très utilisés, comme les saignées, ses observations et sa hardiesse marquèrent son temps (maladies vénériennes, lésions de la tête, opérations des hernies ou des becs de lièvre, etc.). C’est ainsi que, dès 1760, contrairement au dédain qu’affichaient les docteurs de la faculté de Médecine de Paris pour les expertises, il avait discerné toute l'importance de l'enquête médico-légale. Ayant complété sa formation, il fut reçu docteur en droit et avocat au Parlement de Paris où ses rapports et ses consultations firent autorité. D’une certaine façon, il peut être considéré comme le fondateur de la médecine légale. Son intervention dans la célèbre affaire Calas, au titre de médecin légiste, fut cruciale pour la réhabilitation de Jean Calas exécuté pour un crime qu’il n’avait pas commis.
C’est aussi à ce même titre qu’il fut consulté par le Comité de législation pour mettre au point le système de décapitation préconisé par Guillotin dans le cadre de l’égalité des peines de mort. Egalement partisan de la décapitation, qu’il considérait comme le mode le plus prompt à supprimer la vie, Antoine Louis avait publié une Lettre sur la certitude des signes de la mort (1747).
Les machines « à décoller » existaient déjà depuis longtemps mais, se basant sur des considérations anatomiques, il améliora le dispositif en inventant le couteau oblique qui, après avoir été expérimenté sur des cadavres et des moutons, fut adopté. Le facteur de pianos allemand Tobias Schmidt construisit la première machine du genre en 1792. Testée en place de Grève le 17 avril sur trois cadavres, le 25, Nicolas Jacques Pelletier eut le « privilège » d’être le premier criminel condamné à mort à la tester. De suite surnommée la « Louison » ou la « Louisette », Antoine Louis mourut avant de constater que, bien malgré lui, il avait pris part à une tragédie.