Après s'être conduit vaillamment pendant la bataille de France, et rendant responsable la IIIème République de la débâcle, il fut de ce petit nombre qui, avant la fin de l'année 1940, se décida à rejoindre la Résistance. Membre du réseau du Musée de l'homme, il échappa de peu à son démantèlement. Participe à la formation des groupes de résistance Libération-Nord et Organisation civile et militaire dans la zone occupée, il devint chef de la section presse et propagande de la Confrérie Notre-Dame sous le nom de code Pedro.
Rejoignant Charles de Gaulle à Londres (1942), il travailla plus spécifiquement pour le BCRA (services de renseignement), au sein duquel son intelligence le désigna pour des missions très délicates. Avec André Dewavrin (alias le colonel Passy) et Forest Yeo-Thomas (alias "Shelley"), Brossolette, devenu Brumaire", parvint à unifier l'ensemble des mouvements de résistance de la Zone Occupée.
Ayant des vues différentes de Jean Moulin quant à la conduite des opérations de résistance et au régime politique futur de la France, les deux hommes se heurtèrent souvent. En fait, ils se détestaient. Sans doute Brossolette ne se distinguait-il pas non plus par un caractère facile. Intransigeant et cassant, il n'hésitait pas à bousculer le général de Gaulle sur sa façon de traiter les problèmes et les hommes. Mais ces divergences n’entamaient en rien la résolution commune et sans faille de ces hommes à poursuivre le combat contre l'envahisseur.
Après l'arrestation de Moulin, Brossolette tenta vainement de le remplacer. Non seulement la majorité des cadres de la clandestinité s'y opposaient, mais de Gaulle, qui n'a pas songé un instant à nommer quelqu'un lui ayant désobéi, dut le convoquer à Londres parce qu'il continuait à défier ses instructions.
Activement recherché, Brossolette avait échappé plusieurs fois à la Gestapo. Le 3 février 1944, alors qu’il tentait de rejoindre l’Angleterre par la mer, son esquif fit naufrage. Echoué avec plusieurs hommes, recueilli par la résistance locale, il fut arrêté lors d’un barrage de routine à Audierne.
Transféré au quartier général de la Gestapo 84 avenue Foch à Paris, il fut identifié le 19 mars sans qu’on sache de quelle fuite ou imprudence il fut victime.
Torturé, le 22 mars, il opta pour le suicide. Pendant la pause-déjeuner de son gardien, menotté dans le dos, il se serait levé de sa chaise, aurait ouvert la fenêtre de la chambre de bonne au 4ème étage dans laquelle il était enfermé, et s’écrasa devant l’immeuble. Gravement blessé, il succomba à ses blessures à l'hôpital de la Salpêtrière, sans avoir parlé.