Même si l’accession au trône était ouverte aux femmes, Henry voulait un fils. Catherine, dans sa peur de ne plus pouvoir procréer lui reprocha ses infidélités. Henry, de son côté, ne pardonnait pas à son beau-père d’avoir trahi l’alliance conclue contre la France. Bref, l’ambiance entre les époux se dégrada d’autant plus que le roi avait un enfant mâle de l’une de ses maîtresses et qu’il finit par succomber aux charmes d’Anne Boleyn.
Prêt à tout pour se séparer de sa femme, Henry n’hésita pas à brandir le Lévitique pour alléguer que tout bien considéré son mariage était un péché au regard de Dieu puisque « Quand un homme prend la femme de son frère, il commet une impureté. Il a découvert la nudité de son frère. Ils n’auront point d’enfants ». Les partisans de Catherine eurent beau lui faire lecture d’un autre extrait attestant du contraire, Henry, du sommet de sa mauvaise foi et de sa volonté à rompre son union, n’en avait cure : Catherine fut répudiée en 1533 avant que, devenu chef de l’Eglise anglicane, il ne prononçât lui-même son divorce.
Catherine paya cher son entêtement à ne pas céder. Assignée à résidence au château de Kimbolton pour avoir refusé d’échanger son titre de reine contre celui de princesse douairière, on ne l’autorisait pas davantage à voir sa fille. Même la satisfaction de la revanche ne lui fut pas accordée puisqu’elle mourut, peut-être d’un cancer, abandonnée de tous quatre mois avant la fin de sa rivale, Anne Boleyn.
Son mauvais état de santé empira le 29 décembre 1535. Henry lui refusa la visite de sa fille. Seuls, sa gouvernante, María de Salinas et Chapuys, l’ambassadeur d’Espagne, deux fidèles amis, purent consoler ses derniers instants.
Elle fut inhumée comme Princesse de Galles et non comme reine dans l’abbaye de Peterborough, devenue cathédrale, où sa sépulture est toujours visible. Aujourd’hui encore, l’anniversaire de sa mort est l’occasion d’offices en sa mémoire.