Sans enfants de cette union, elle s’occupa de ceux que François Ier avait eus avec Claude de France. Lorsque le dauphin François et Henri (futur Henri II) avaient été laissé en otages en Espagne à la libération de leur père, Eléonore avait déjà tenté d’adoucir leur sort durant leur emprisonnement.
Elle tenait si peu de place dans la famille royale, qu’elle ne fut avertie du décès de son mari que deux jours après l’événement ! Entourée d’une telle considération, on comprend qu’elle préférât se rendre aux Pays-Bas, puis se retirer en Espagne, à Yuste, auprès de Charles Quint, qui venait d’abdiquer, et de sa sœur Marguerite de Hongrie.
Début 1558, Eléonore désira revoir sa fille Maria qui demeurait au Portugal et dont elle avait dû se séparer. A Badajoz, près de la frontière portugaise, la rencontre entre la mère et la fille se passa mal. Maria refusa de quitter le Portugal. Est-ce de contrariété ? Sur le chemin du retour, Eléonore fut prise de violentes crises d’asthme et décéda à Talavera.
Elle fut inhumée dans la nécropole madrilène peu avant que son frère n'y rejoigne sa propre tombe.
Elle repose dans le Panthéon des Infants.