Mais alors qu’à la mort du pape Innocent III, il pouvait espérer chausser les souliers de saint Pierre ce furent les pieds d’Alexandre Borgia qui les enfilèrent sous le nom d’Alexandre VI. Et jusqu’à la mort de ce dernier, Della Rovere resta dans l’opposition. Il tenta bien de le faire déposer en accompagnant Charles VIII dans sa marche sur Naples et dans son entrée dans Rome, ce fut en vain. A la disparition d’Alexandre VI, le temps d’un autre mais bref pontificat et il fut élu pape sous le nom de Jules II. Sa première mesure fut de faire rendre à César Borgia des places de Romagne qu’il s’était attribuées en accord avec son père, de l’emprisonner et de l’expédier en Espagne.
Pour faire face à sa politique d’interventions militaires, toujours pour récupérer des places de la Romagne, et à ses commandes somptuaires, il put compter sur un habile banquier siennois. Toutefois, ses campagnes militaires, notamment celle contre Venise, étaient impossibles sans jouer habilement avec les deux puissances présentes en Italie, la France et l’Espagne, quitte à changer de camp au gré de ses intérêts. C’est ainsi qu’une fois repris à Venise, grâce aux Français, des territoires usurpés, il se retourna contre eux.
Jules II reconstitua et consolida les Etats de l’Eglise, il para Rome des plus grands chefs-d’œuvre de l’art. Mais en utilisant sans mesure les armes temporelles et spirituelles en pratiquant systématiquement le renversement des alliances, il se conduisit davantage comme un prince laïc qu’en souverain pontife. Cette attitude, liée à l’étalage des gloires mondaines, devait accroître les critiques des contemporains à l’égard de la papauté et justifier le mouvement de réforme radicale qui fut déclenché par Luther sous le pontificat suivant avec l'achat des Indulgences.
On lui doit la création de la Garde suisse en 1505.
Il mourut alors que les murs de la nouvelle basilique Saint-Pierre, dont il avait posé la première pierre et qui lui doit sa magnificence, commençaient à surgir de terre.
Au début de son règne, il avait modestement envisagé son tombeau au-dessus de celui de saint Pierre. Finalement, Jules II fut inhumé en la basilique Saint-Pierre-aux-Liens dont le nom évoque les chaînes que porta l’Apôtre à Jérusalem et à Rome conservées dans un reliquaire.L’édifice subit des reconstructions sous son pontificat.
Commandité par lui-même en 1505 à Michel-Ange pour être placé au centre de la nouvelle basilique Saint-Pierre de Rome, le projet initial comportait trois étages et une quarantaine de figures. Souvent remanié jusqu'en 1545, il se réduisit à la version visible aujourd'hui de deux étages. Certaines des statues sont de la main du maître (Moïse, Les Esclaves, Léa et Rachel, Les filles de Laban), d'autres de ses assistants et élèves.