Devenu veuf, ordonné prêtre en 1551, il entra dans la Compagnie de Jésus, en fut nommé général et n’eut de cesse de développer et d’organiser son ordre. On le retrouva aussi sur le front de missions diplomatiques comme tenter de marier Marguerite de France à Sébastien, roi de Portugal, plutôt qu’à l’hérétique futur Henri IV.
Son humilité et sa réputation de saint homme le firent surpasser en tout ses illustres prédécesseurs. Quand Charles Quint se retira à Yuste, François était l’un des rares dont l’empereur acceptait les visites avec plaisir.
Puis un jour, pour avoir négligé de soigner une pleurésie, François tomba gravement malade à Ferrare et mourut peu après à Rome dans les échos du massacre de la Saint-Barthélemy.
Ses funérailles romaines furent à la hauteur de sa renommée. Il fut inhumé un temps dans l'église du Gesù à Rome. Puis, en 1607, à la demande de son petit-fils, premier ministre du roi Philippe III d’Espagne, et de Gaspard de Borgia alors ambassadeur d’Espagne, on entama la procédure de béatification.
En 1617, sa dépouille fut transférée à Madrid dans un délire de solennités. Sept ans plus tard, le 21 novembre 1624, jour de sa béatification, son corps fut promené dans un Madrid en liesse.
François de Borgia fut canonisé le 11 avril 1671. Épargné par le décret de Joseph Bonaparte qui, en 1809, ordonnait la confiscation de tous les lieux saints et des objets précieux, le reliquaire d'argent contenant les restes du saint, après des diverses vicissitudes, fut confié, en 1901, à l'église de la Maison professe de Madrid. En mai 1931, lors des manifestations anticléricales, ses reliques disparurent en grande partie dans l’incendie qui ravagea l’église.